Этот метод основан на различиях в скоростях седиментации частиц, отличающихся друг от друга размерами и плотностью. Разделяемый материал, например гомогенат ткани, центрифугируют при ступенчатом увеличении центробежного ускорения, которое выбирается так, чтобы на каждом этапе на дно пробирки осаждалась определенная фракция. В конце каждой стадии осадок отделяют от надосадочной жидкости и несколько раз промывают, чтобы в конечном итоге получить чистую осадочную фракцию. К сожалению, получить абсолютно чистый осадок практически невозможно; чтобы понять, почему это происходит, обратимся к рассмотрению процесса, происходящего в центрифужной пробирке в начале каждой стадии центрифугирования.
Сначала все частицы гомогената распределены по объему центрифужной пробирки равномерно, поэтому получить чистые препараты осадков самых тяжелых частиц за один цикл центрифугирования невозможно: первый образовавшийся осадок содержит в основном самые тяжелые частицы, но, кроме этого, также некоторое количество всех исходных компонентов. Получить достаточно чистый препарат тяжелых частиц можно лишь при повторном суспендировании и центрифугировании исходного осадка. Дальнейшее центрифугирование супернатанта при последующем увеличении центробежного ускорения приводит к седиментации частиц средних размеров и плотности, а затем и к осаждению самых мелких частиц, имеющих наименьшую плотность. На рис. 2.3 изображена схема фракционирования гомогената печени крысы.
Дифференциальное центрифугирование является, по-видимому, самым распространенным методом выделения клеточных органелл из гомогенатов тканей. Наиболее успешно применяется этот метод для разделения таких клеточных органелл, которые значительно отличаются друг от друга по размерам и плотности. Но даже и в этом случае получаемые фракции никогда не бывают абсолютно гомогенными, и для их дальнейшего разделения применяют другие методы, описанные ниже. Эти методы, основанные на различиях в плотности органелл, обеспечивают более эффективное разделение благодаря тому, что центрифугирование осуществляют в растворах с непрерывным или ступенчатым градиентом плотности. Недостатком этих методов является то, что приходится тратить время на получение градиента плотности раствора.
Зонально-скоростное центрифугирование
Метод зонально-скоростного, или, как его еще называют, s-зонального центрифугирования, заключается в наслаивании исследуемого образца на поверхность раствора с непрерывным градиентом плотности. Затем образец центрифугируют до тех пор, пока частицы не распределятся вдоль градиента в виде дискретных зон или полос. Благодаря созданию градиента плотности удается избежать смешивания зон, возникающего в результате конвекции. Метод зонально-скоростного центрифугирования применяется для разделения гибридов РНК--ДНК, субъединиц рибосом и других клеточных компонентов.
Лейбих (циг. по С. Граник, 1962) установил, что в меристематических тканях железо необходимо для синтеза железосодержащих ферментов митохондрий; 82% его сосредоточено в хлоропластах, в ядрах найдены только следы. В то же время А.Ф. Агафонова, Н.С. Чаплыгина (1962), исследуя поглощение железа растениями и его распределение внутри клетки, приходят к выводу, что в клеточных ядрах паренхимы листьев кукурузы содержалось больше железа, чем в хлоропластах и структурах митохондриального типа. Содержание железа в последних было ниже, чем в хлоропластах.
В работе Дж. Скока (1962) приводятся некоторые данные о локализации бора в клеточных структурах. Автор указывает, что митохондрии и микросомы содержат меньше бора, чем ядра, пластиды и надосадочная жидкость. Для осуществления различных клеточных функций используется бор, содержащийся в диализируемой фракции надосадочной жидкости.
Мы совместно с З.М. Климовицкой, Л.Д. Лейденской и Э.В. Рудаковой в 1961-1953 гг. изучали локализацию микроэлементов марганца, молибдена и цинка в клеточных структурах растений, а также содержание микроэлементов в связи с онтогенезом растений. Был использован метод дифференциалы ого центрифугирования, дающий возможность выделить цитоплазму и органоиды клетки: ядра, хлоропласта, митохондрии. Мы придерживались методики выделения клеточных структур, предложенной Н.С. Сисакяном, И.М. Мосоловой (1961-1962).
В 1961 г. работу проводили на центрифуге с охлаждением и общей разрешающей способностью 30 000 g. Из гомогенатов листьев сахарной свеклы (сорт Верхнячская 020) в 0,35 M растворе сахарозы при 2500 g выделены крупные фрагменты клеток, при 4500 g - хлоропласта, при 17 000 g - митохондрии. Выделенные фракции сжигали. В полученной золе определяли марганец. Содержание его выражали в миллиграммах в пересчете на ту или иную фракцию, выделенную из 1 кг сырого вещества растении. Так, в крупных фрагментах клеток содержалось 20,88 мг/кг марганца, или 44,5%; в хлоропластах - 3,46, или 7,5; в митохондриях - 2,05, или 4,3; в незеленых цитоплазменных структурах - 20,43 мг/кг, или 43,7%. Препараты хлоропластов идентифицировали по их характерной люминесценции.
Максимальное количество марганца содержалось в незеленых цитоплазменных структурах и крупных фрагментах клеток. При пересчете на содержание марганца в золе каждой фракции максимальное количество его отмечено для фракции хлоропластов и митохондрий. В крупных фрагментах клеток содержалось 325,1 мг марганца на 100 г золы, или 16,3%; в хлоропластах - 823,9, или 42,5; в митохондриях - 500, или 25,1; в незеленых цитоплазменных структурах - 321 мг, или 16,1%, марганца.
В 1962 г. нами была принята следующая методика работы по изучению содержания марганца, молибдена и цинка в клеточных структурах листьев конских бобов и сахарной свеклы. Бобы (сорт Херц-Фрея) и сахарную свеклу (сорт Рамонская 04) выращивали на стационаре опытного хозяйства Института физиологии растений АН УССР на лугово-черноземной оподзоленной почве по фону NPK с добавлением марганца, молибдена и цинка. В начале, середине и конце вегетации мы брали навески листьев (30 г сырого вещества), затем их растирали на льду с 40 мл 0,5 M сахарозы и 10 мл фосфатного буфера (по Серенсену); pH среды 7,1. Полученные гомогенаты подвергали дифференциальному центрифугированию на центрифуге ТМ-14, разрешающая способность которой 20 000 g. Вначале из гомогенатов удаляли крупные фрагменты клеток. Затем на центрифуге при 1500 и 3000 g в течение 10 мин выделяли более мелкие фрагменты (осколки) клеток. Отмечено, что при 3000 g в течение 10 мин оседали ядра. Хлоропласты выделяли в течение 15 мин при 6000 - 10 000 g, а при 14 000 g - митохондрии. Выделенные фракции подвергали повторному центрифугированию с 2 мл сахарозы в течение 10-15 мин при соответствующих для каждой фракции значениях оборотов. Полученные фракции сжигали в муфеле, а в их золе определяли марганец, молибден, цинк. В оставшейся надосадочной жидкости также определяли содержание этих микроэлементов.
Фракции подвергали гистологическому анализу. Под микроскопом просматривали клеточные оболочки, ядра, хлоропласты. Митохондрии нам не удалось идентифицировать. У листьев бобов оказались очень тяжелые форменные элементы; это были преимущественно хлоропласты, которые при 3000-6000 g почти полностью осаждались. Надосадочная жидкость была прозрачной. У сахарной свеклы хлоропласты лучше всего осаждались при 6000-10 000 g. Совершенно прозрачной надосадочной жидкости не удавалось получить даже при 14 000 g. Этим, очевидно, объясняется отсутствие единой методики выделения клеточных структур. Разная степень оседания клеточных структур требует дифференцированных методик их выделения с учетом биологических особенностей каждой культуры.
Количество микроэлементов в клеточных структурах, выделенных методом дифференциального центрифугирования, рассчитывали в миллиграммах на 1 кг сырого вещества навески, в процентах от общего содержания и в миллиграммах на 100 г золы каждой фракции.
Из клеточных структур листьев сахарной свеклы максимальное количество марганца (при пересчете на фракцию, выделенную из 1 кг сырого вещества) сосредоточивается в надосадочной жидкости, т. е. в цитоплазме; в крупных фрагментах клеток (хлоропластах, ядрах, митохондриях) он содержится в убывающем порядке. К середине вегетации количество марганца в листьях сахарной свеклы (табл. 45) возрастает за счет увеличения содержания его в крупных фрагментах клеток и надосадочной жидкости. В органоидах клетки (ядрах, хлоропластах, митохондриях) оно остается довольно постоянным в течение всего периода вегетации.
Что такое центрифугирование? Для чего применяется метод? Термин "центрифугирование" означает разделение жидких либо твердых частиц вещества на различные фракции с помощью центробежных сил. Осуществляется такая сепарация субстанций благодаря использованию специальных аппаратов - центрифуг. В чем же заключается принцип метода?
Принцип центрифугирования
Рассмотрим более детально определение. Центрифугирование - это воздействие на вещества путем сверхскоростного вращения в специализированном аппарате. Главной частью любой центрифуги выступает ротор, который содержит гнезда для установки пробирок с материалом, что подлежит сепарации на отдельные фракции. Во время вращения ротора на повышенных скоростях в действие вступает Вещества, помещенные в пробирки, разделяются на различные субстанции согласно уровню плотности. Например, при центрифугировании образцов подземных вод отделяется жидкость и осаждаются содержащиеся в ней твердые частицы.
Автор метода
Впервые стало известно, что такое центрифугирование, после опытов, проведенных ученым А. Ф. Лебедевым. Метод был разработан исследователем с целью определения состава почвенных вод. Ранее в данных целях использовали отстаивание жидкости с последующим отделением от нее твердых образцов. Разработка метода центрифугирования позволила справляться с этой задачей гораздо быстрее. Благодаря такой сепарации возникла возможность для извлечения твердой доли веществ из жидкости в сухом виде на протяжении считаных минут.
Этапы центрифугирования
Дифференциальное центрифугирование начинается с отстаивания веществ, что подлежат исследованию. Такая обработка материала происходит в аппаратах-отстойниках. В ходе отстаивания частицы вещества разделяются под воздействием гравитации. Это позволяет подготовить субстанции к более качественной сепарации с помощью центробежных сил.
Далее вещества в пробирках подвергаются фильтрации. На этом этапе применяются так называемые перфорированные барабаны, что предназначаются для отделения жидких частиц от твердых. В ходе представленных мероприятий весь осадок остается на стенках центрифуги.
Преимущества метода
По сравнению с прочими методами, направленными на разделение отдельных субстанций, такими как фильтрование или отстаивание, центрифугирование дает возможность получать осадок с минимальным показателем влажности. Применение такого способа сепарации позволяет разделять тонкодисперсные суспензии. Результатом становится получение частиц размером в 5-10 мкм. Еще одним важным преимуществом центрифугирования выступает возможность его выполнения при помощи аппаратуры малых объемов и габаритов. Единственным недостатком метода выступает высокая энергоемкость приборов.
Центрифугирование в биологии
В биологии к сепарации веществ на отдельные субстанции прибегают при необходимости подготовки препаратов для исследования под микроскопом. Центрифугирование здесь производится на сложных устройствах - цитороторах. Такие аппараты помимо слотов для пробирок комплектуются держателями образцов, всевозможными предметными стеклами непростой конструкции. От устройства центрифуги при проведении исследований в биологии напрямую зависит качество получаемых материалов и, соответственно, количество полезной информации, которую можно почерпнуть из результатов анализа.
Центрифугирование в нефтеперерабатывающей промышленности
Метод центрифугирования незаменим при добыче нефти. Существуют углеводородные ископаемые, из которых не полностью выделяется вода при дистилляции. Центрифугирование дает возможность убрать лишнюю жидкость из состава нефти, повысив ее качество. В данном случае нефть растворяют в бензоле, затем нагревают до 60 о С, а затем подвергают воздействию центробежной силы. В завершение замеряют количество оставшейся воды в веществе и при необходимости повторяют процедуру.
Центрифугирование крови
Этот метод широко применяется для лечебных целей. В медицине он позволяет решать следующий ряд задач:
- Получение очищенных образцов крови для проведения плазмафереза. В данных целях в центрифуге отделяют форменные элементы крови от ее плазмы. Операция дает возможность избавить кровь от вирусов, избыточных антител, болезнетворных бактерий, токсинов.
- Подготовка крови для донорского переливания. После разделения телесной жидкости на отдельные фракции при помощи центрифугирования донору возвращают клетки крови, а плазма применяется для переливания либо замораживается в целях последующего использования.
- Выделение тромбоцитарной массы. Субстанцию получают из Полученную массу используют в хирургических и гематологических отделениях медицинских учреждений, в неотложной терапии, операционных. Применение тромбоцитарной массы в медицине дает возможность улучшить свертываемость крови у пострадавших.
- Синтез эритроцитарной массы. Центрифугирование клеток крови происходит путем деликатной сепарации ее фракций согласно специальной методике. Готовую массу, богатую эритроцитами, используют для переливания при кровопотерях, операциях. Эритроцитарная масса нередко применяется в целях лечения анемии, прочих заболеваний крови системного характера.
В современной медицинской практике применяется немало приборов нового поколения, которые дают возможность разгонять вращающийся барабан до определенной скорости и останавливать его в определенный момент. Это позволяет более точно разделять кровь на эритроциты, тромбоциты, плазму, сыворотку и сгустки. Аналогичным способом исследуются прочие телесные жидкости, в частности сепарируются вещества в составе мочи.
Центрифуги: основные типы
Мы разобрались, что такое центрифугирование. Теперь давайте выясним, какие аппараты применяются для реализации метода. Центрифуги бывают закрытыми и открытыми, с механическим или ручным приводом. Основной рабочей частью ручных открытых приборов выступает вращающаяся ось, расположенная вертикально. В ее верхней части перпендикулярно закреплена планка, где располагаются подвижные металлические гильзы. В них помещаются специальные пробирки, зауженные в нижней части. На дно гильз укладывают вату, что позволяет избежать повреждения стеклянной пробирки при соприкосновении с металлом. Далее аппарат приводят в движение. По истечении некоторого времени происходит отделение жидкости от твердых взвешенных частиц. После этого ручную центрифугу останавливают. На дне пробирок концентрируется плотный, твердый осадок. Над ним находится жидкая часть вещества.
Механические центрифуги закрытого типа обладают большим количеством гильз для размещения пробирок. Такие приборы более удобны по сравнению с ручными. Их роторы приводятся в движение мощными электромоторами и способны разгоняться до 3000 оборотов в минуту. Это дает возможность осуществлять более качественную сепарацию жидких субстанций от твердых.
Особенности подготовки пробирок при центрифугировании
Пробирки, что применяются для центрифугирования, должны быть наполнены исследуемым материалом идентичной массы. Поэтому для измерений здесь применяются специальные высокоточные весы. Когда требуется уравновешивание многочисленных пробирок в центрифуге, прибегают к следующему приему. Взвесив пару стеклянных емкостей и добившись одинаковой массы, одну из них оставляют в качестве эталона. Последующие пробирки уравновешивают с этим образцом, прежде чем поместить в аппарат. Такой прием существенно ускоряет работу при необходимости подготовки к центрифугированию целой серии пробирок.
Стоит заметить, что в пробирки никогда не помещают слишком много исследуемой субстанции. Стеклянные емкости наполняют таким образом, чтобы расстояние до края составляло не менее 10 мм. Иначе вещество будет выливаться из пробирки под воздействием центробежной силы.
Сверхцентрифуги
Для разделения составляющих чрезвычайно тонких суспензий недостаточно применения обычных ручных либо механических центрифуг. В данном случае требуется более внушительное воздействие на вещества со стороны центробежных сил. При реализации таких процессов применяются сверхцентрифуги.
Аппараты представленного плана оснащаются глухим барабаном в виде трубки незначительного диаметра - не более 240 мм. Длина такого барабана значительно превышает его сечение, что дает возможность в значительной степени повысить количество оборотов и создать мощнейшую центробежную силу.
В сверхцентрифуге исследуемое вещество поступает внутрь барабана, движется по трубке и ударяется о специальные отражатели, что отбрасывают материал на стенки прибора. Здесь же имеются камеры, предназначенные для раздельного вывода легких и тяжелых жидкостей.
К достоинствам сверхцентрифуг относятся:
- абсолютная герметичность;
- высочайшая интенсивность сепарации веществ;
- компактные размеры;
- возможность разделения субстанций на молекулярном уровне.
В заключение
Вот мы и выяснили, что такое центрифугирование. В настоящее время метод находит свое применение при необходимости выделения осадков растворов, очищения жидкостей, разделения компонентов биологически активных и химических веществ. Для сепарации субстанций на молекулярном уровне применяются ультрацентрифуги. Метод центрифугирования активно используется в химической, нефтяной, атомной, пищевой промышленности, а также в медицине.
Помимо микроскопии, другим основным и широко распространенным методом изучения клеток является дифференциальное центрифугирование или фракционирование.
Принцип метода состоит в том, что при центрифугировании развивается центробежная сила, под воздействием которой взвешенные частицы оседают на дно центрифужной пробирки.
После того, как в начале 40-х годов начали использовать ультрацентрифугу, разделение клеточных компонентов стало вполне реальным.
Прежде, чем подвергнуть клетки центрифугированию, их необходимо разрушить - разрушить жесткий каркас клеточных оболочек. Для этого используют различные методы: ультразвуковую вибрацию, продавливание через маленькие отверстия или самое обычное измельчение растительных тканей пестиком в фарфоровой ступе. При осторожном применении методов разрушения можно сохранить некоторые органеллы целыми.
При высокоскоростном центрифугировании крупные компоненты клетки (например, ядра) быстро оседают (седиментируют), при относительно низких скоростях и образуют осадок на дне центрифужной пробирки. При более высоких скоростях в осадок выпадают более мелкие компоненты, такие как хлоропласты и митохондрии.
То есть при центрифугировании компоненты клетки распадаются на фракции: крупные и мелкие, поэтому второе название метода? фракционирование. При этом, чем выше скорость и длительность цетрифугирования, тем мельче полученная фракция.
Скорость седиментации (осаждения) компонентов выражается с помощью коэффициента седиментации, обозначаемого S.
Этапы дифференциального центрифугирования: низкая скорость (ядра, цитоскелет), средняя скорость (хлоропласты), высокая скорость (митохондрии, ризосомы, микротельца), очень высокая скорость (рибосомы).
Фракционированные клеточные экстракты, называемые также бесклеточными системами, широко используются для изучения внутриклеточных процессов. Только работая с бесклеточными экстрактами, можно установить детальный молекулярный механизм биологических процессов. Так, использование именно этого метода принесло триумфальный успех в изучении биосинтеза белка.
Дифференциальное центрифугирование
Для получения клеточных фракций широко применяются различные виды центрифугирования: дифференциальное центрифугирование, зональное центрифугирование и равновесное центрифугирование в градиенте плотности. Теоретические и практические вопросы, связанные с центрифугированием, всесторонне разобраны в обзоре Сайкса .
В случае дифференциального центрифугирования образцы центрифугируют определенное время при задан
ие
ной скорости, после чего удаляют надосадочную жидкость. Этот метод полезен для разделения частиц, сильно различающихся по скорости седиментации. Например, центрифугирование в течение 5-10 мин при 3000- 5000 g приводит к осаждению интактных бактериальных клеток, тогда как большинство клеточных фрагментов при этом остается в надосадочной жидкости. Фрагменты клеточной стенки и большие мембранные структуры можно осадить центрифугированием при 20 000-50 000 g в течение 20 мин, в то время как маленькие мембранные везикулы и рибосомы требуют для осаждения центрифугирования при 200 000 g в течение 1 ч.
Зональное центрифугирование
Зональное центрифугирование представляет собой эффективный способ разделения структур, имеющих сходную плавучую плотность, но различающихся по форме и массе частиц. В качестве примеров можно привести разделение субъединиц рибосом, различных классов полисом, а также молекул ДНК, имеющих различную форму. Центрифугирование осуществляют либо в бакет-роторах, либо в специально устроенных зональных роторах; для предотвращения конвекции при центрифугировании в стаканах бакет-ротора или в камере зонального ротора создают слабый градиент (обычно сахарозы). Пробу наносят в виде зоны или узкой полосы в самом верху градиентного столбика. Для субклеточных частиц обычно используется градиент сахарозы от 15 до 40% (вес/объем); большинство этих частиц в достаточной степени разделяется центрифугированием при 100000 g в течение 1-4 ч.
Равновесное центрифугирование в градиенте плотности
При этом виде центрифугирования частицы разделяются по плавучей плотности, а не по скорости седиментации. Метод широко применяется для разделения различных фракций мембран, так как фрагменты мембран, относящиеся к одному и тому же типу, могут сильно различаться по размеру (и, следовательно, скорости седиментации), но должны иметь одинаковую плавучую плотность. Исследуемые компоненты движутся при цент-рифугировании в градиенте плотности растворенного вещества (для мембран и органелл с плотностью ниже
г/мл обычно используются сахарозные градиенты, а для более плотных структур, таких, как вирусы, применяют соли винной кислоты и хлористый цезий) до тех пор, пока не будет достигнуто равновесное положение, при котором плотность каждой частицы равна плотности окружающего раствора. Поскольку растворы сахарозы относительно вязкие, градиенты, как правило, фор-мируют заранее. У растворов хлористого цезия вязкость низкая, так что трудно заранее приготовить его градиентный раствор; в этом случае применяют технику изопикнического центрифугирования в градиенте плотности. Пробу смешивают с хлористым цезием в количестве, достаточном для создания плотности, равной средней плотности субклеточных частиц. Эту гомогенную смесь помещают в сосуд для центрифугирования, и в результате седиментации хлористого цезия в поле центробежных сил при центрифугировании формируется его градиент.
Поскольку скорость седиментации частицы постепенно снижается по мере достижения ею той области градиента, где она имеет плотность одинаковую с плотностью раствора, для достижения равновесия центрифугировать требуется очень долго. Это особенно важно для маленьких мембранных везикул, таких, как хроматофори, или для фрагментов цитоплазматических мем-бран клеток, разрушенных на прессе Френча, так как скорость седиментации этих частиц низка даже в отсутствие градиента. Если применять центробежные ускорения порядка 100 000-200 000 g, для более или менее хорошего разделения требуется не меньше 24 ч, а для полного - 72 ч.
Градиенты сахарозы
Концентрация сахарозы в растворах для приготовления градиентов указывается в литературе по-разному: в единицах плотности, в молях сахарозы, в весовых процентах сахарозы (вес/вес), в процентах на единицу объема (вес/объем или г/100 мл). В стандартных химических справочниках есть таблицы для перевода концентраций водных растворов сахарозы из одних единиц в другие. Чаще всего используются весовые проценты са-харозы. При приготовлении сахарозных растворов плотность воды или разбавленных буферов принимают равной 1 г/мл. Следовательно, чтобы приготовить, например, раствор 54%-ной (вес/вес) сахарозы, нужно растворить 54 г сахарозы в 46 мл воды. При этом образуется 100 г раствора, а поскольку плотность 54%-ного (вес/вес) раствора сахарозы равна 1,2451, конечный объем будет 80,3 мл. Приготовление растворов таким путем устраняет необходимость доведения вязких растворов до фиксированных величин объема.
Для создания градиентов промышленностью выпускаются разнообразные устройства, но их применение не обязательно, так как удовлетворительные по качеству градиенты можно приготовить, наслоив друг на друга в центрифужном стакане ряд сахарозных растворов и выдержав в течение ночи, чтобы за счет диффузии образовался непрерывный градиент. Нет необходимости выдерживать градиенты, которые будут центрифугироваться 24 ч и больше, так как за время центрифугирования благодаря диффузии сформируется непрерывный градиент. Мы обычно готовим градиенты из пяти-семи слоев. Когда используются смачиваемые центрифужные стаканы, например, из нитроцеллюлозы или поликарбоната, слои можно наносить, давая им стекать вниз по стенке стакана из пипетки, которую держат под углом к стенке. Если берут несмачиваемые стаканы, такие, как полиалломерные или полипропиленовые, то кончик пипетки при добавлении раствора должен находиться в контакте с мениском, чтобы не происходило перемешивания.
Самый простой метод отбора фракций из сахарозных градиентов заключается в их выкачивании с по-мощью перистальтического насоса. Центрифужный стакан зажимают в круглых лапках (мы применяем кусок прозрачного плекса с просверленным по диаметру стакана отверстием, который зажимаем в лапках), а над ним в круглых лапках закрепляют трубочку небольшого диаметра из нержавеющей стали. Трубочку подсоединяют к насосу и опускают в стакан до соприкосновения с дном. Затем градиентный столбик с помощью насоса раскапывают по находящимся в коллекторе фракций мерным пробиркам.
Детергенты
Детергенты применяются при фракционировании клеток в трех случаях. Когда хотят получить немембранные органеллы, такие, как рибосомы, нуклеоиды и т. д., детергенты обеспечивают мягкое лизирование клеток после нарушения целостности муреина (грамположи- тельные бактерии) или наружной мембраны (грамотри- цательные бактерии). Детергенты применяют также для того, чтобы избирательно перевести в раствор цитоплазматическую мембрану грамотрицательных бактерий, сохранив интактной наружную мембрану, или удалить мембранные загрязнения с рибосом, полисом и стенок грамположительных клеток.
Детергенты представляют собой амфипатические молекулы, т. е. молекулы, имеющие как гидрофильную, так и гидрофобную области; они умеренно растворяются в воде. В очень низких концентрациях детергенты образуют в воде истинный раствор. По мере возраста-ния концентрации молекулы детергента агрегируют с образованием мицелл, в каждой из которых гидрофильные области обращены к воде, а гидрофобные скрыты от воды внутри мицеллы. Концентрацию, при которой по мере добавления детергента к воде начинают образовываться мицеллы, называют критической концентрацией мицеллообразования (ККМ). Каждый детергент характеризуется своими ККМ, размерами и формой ми-целл. Превосходный обзор Хелениуса и Симонса суммирует свойства многих детергентов, применяемых для получения клеточных фракций.
Детергенты можно подразделить на три класса, различающиеся по свойствам мицелл, способности связываться с белками и способности взаимодействовать с другими растворенными веществами. К этим классам относятся ионные детергенты, неионные детергенты и соли желчных кислот. С каждым детергентом связаны свои трудности и свои преимущества при фракционировании клеток.
Ионные детергенты
К самым распространенным ионным детергентам относятся додецилсульфат натрия (лаурилсульфат натрия, ДСН), N-лаурилсаркозинат натрия (саркозил), алкил- бензосульфонаты (обычные, применяемые в домашнем хозяйстве детергенты) и соли четвертичных аминов, такие, как бромид цетилтриметиламмония (цетавлон). Ионные детергенты склонны образовывать небольшие мицеллы (с мол. массой - 10 ООО) и имеют относительно высокую ккм (для ДСН ККМ при комнатной температуре в разведенных буферах составляет примерно 0,2%). На ККМ и растворимость ионных детергентов сильно влияют ионная сила раствора и природа присутствующих в нем противоионов. К примеру, 10%-ный раствор ДСН теряет стабильность при температуре около 17 °С, в то время как сходный раствор додецилсуль- фата в трисе стабилен при 0°С. Додецилсульфат калия растворим только при повышенных температурах, и поэтому при использовании этого детергента К+ следует исключать из всех буферов.
Такие детергенты, как ДСН, которые имеют сильно ионизированную гидрофильную группу, не подвержены влиянию изменения реакции среды в широком диапазоне pH и не осаждаются 5%-ной трихлоруксусной кислотой. Ионные детергенты сильно связываются с белками, и в случае ДСН обычно происходит разворачивание и необратимая денатурация белковых молекул. Хотя ионные детергенты можно удалить диализом, как правило, этого не делают из-за значительного связывания их с белками.
Неионные детергенты
К неионным детергентам относятся тритон Х-100, нонидет Р-40 (NP-40), твин 80 и октилглюкозид. Обычно мицеллы этих детергентов обладают большой моле-кулярной массой (50 000 и больше) и низкой ККМ (0,1% и ниже), что ограничивает их применимость при гель-фильтрации или гель-электрофорезе. На свойства этих детергентов в растворе почти не влияют реакция среды и ионная сила, хотя они могут осаждаться 5%-ной трихлоруксусной кислотой. Неионные детергенты связываются только с гидрофобными белками и, как правило, не вызывают денатурации или потери биологической активности.
Соли желчных кислот
Соли желчных кислот представляют собой соли сте- риновых производных, например холат, дезоксихолат или таурохолат натрия. Из-за того что массивные стери- новые ядра плохо упаковываются, эти детергенты образуют небольшие мицеллы (часто всего из нескольких молекул), а молекулярная масса последних в отличие от других детергентов является функцией концентрации детергента. Поскольку эти детергенты - соли очень плохо растворимых кислот со значениями рКа в области 6,5-7,5, их следует использовать в щелочных диапазонах значений pH. Чтобы избежать трудностей с растворением, применяют концентрированные исходные растворы, которые готовят, растворяя в избытке NaOH соответствующую свободную кислоту. При работе с этими детергентами ионный состав, значение pH и общая концентрация детергента должны поддерживаться на по-стоянном уровне.
Проблемы,
возникающие при использовании детергентов
Поскольку большинство детергентов используется в концентрациях, довольно сильно превосходящих ККМ, и поскольку действие детергентов обусловлено образованием смешанных мицелл с липидами или связыванием с белками, отношения детергент: белок или детер-гент: липид значительно важнее истинной концентрации детергента. Как правило, достаточный избыток детергента обеспечивается при соотношении 2-4 мг детергента к 1 мг белка. Например, если для солюбилизации мембран используется 2%-ный тритон Х-100, концентрация белка в пробе должна быть не больше 5-10 мг/мл.
Тритон Х-100, один из самых ценных неионных детергентов, создает трудности при измерениях количества белка, поскольку он содержит ароматический остаток, препятствующий измерению поглощения при 280 нм, а в пробах с участием химических реагентов образует мутный осадок. Мы обычно преодолеваем эту трудность с помощью мечения культуры небольшим количеством 3Н-лейцина. Если метка вводится в минимальную или синтетическую солевую среду, следует позаботиться о том, чтобы добавить туда достаточное количество немеченого лейцина, обеспечив тем самым постоянное в течение всего периода роста включение изотопа из расчета на 1 мг белка. Для Е. coliдостаточно добавить в качестве носителя 20-40 мкг немеченого лейцина, чтобы достичь равномерного включения метки. Когда ввести метку по каким-либо соображениям невозможно, содержание белка измеряют и в присутствии тритона Х-100 модифицированным методом Лоури, описанным в работе [П]. в соответствии с которым к пробе добавляют избыток ДСН. Последний образует стабильные смешанные мицеллы с тритоном, не мешающие измерениям.
Тритон Х-100 и другие сходные с ним неионные детергенты растворяются в водно-спиртовых смесях, а белки из таких смесей можно выделить осаждением в этаноле. Пробу помещают на лед и к ней добавляют при перемешивании 2 объема охлажденного на льду абсолютного этанола. Смесь выдерживают в течение ночи в морозильнике и собирают осадок белка центрифугированием. Для эффективного осаждения требуется концентрация белка не меньше 0,2 мг/мл. Разбавленные растворы белка концентрируют в аппарате для ультрафильтрации фирмы Amicon с помощью фильтра РМ-30. Правда, следует иметь в виду, что при этом концентрируются также и мицеллы детергента.
ДСН удаляют из проб ацетоновым осаждением. Шесть объемов безводного ацетона добавляют к пробе при комнатной температуре, а выпавший осадок отделяют центрифугированием. Осадок промывают несколько раз водно-ацетоновой смесью (б -1). Так как осадок часто оказывается воскообразным и с ним трудно работать, мы обычно диспергируем его в воде гомогенизатором Поттера, а затем лиофилизуем.
Электрофорез в полиакриламидном геле
Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии ДСН представляет собой самый простой и самый эффективный способ выявления набора полипептидов, присутствующих в субклеточных фракциях. Этот метод сейчас во многих случаях заменяет ферментативный и химический анализ при установлении чистоты и гомогенности субклеточных фракций.
Для электрофореза в полиакриламидном геле используются разнообразные выпускаемые промышленностью и самодельные приборы. Мы предпочитаем те приборы, которые позволяют проводить разделение в тонких пластинах геля, что обеспечивает оптимальное разрешение. Лучшее разрешение на пластинах обусловлено тем, что возникающее во время электрофореза тепло здесь легко рассеивается, а также тем, что гель после электрофореза можно быстро фиксировать. Последнее важно для того, чтобы свести к минимуму диффузию белка в полосах. Пластины позволяют одновременно сравнивать много проб, и их легко сохранять после высушивания на листах фильтровальной бумаги. Радиоактивность в пробах выявляют радиоавтографией и фотофлюорографией, а высушенные на фильтровальной бумаге гели можно легко нарезать ножницами или резаком и после повторного насыщения водой вырезанных сухих полосок просчитывать на сцинтилляционном счетчике. Если не требуется большая разгонка в геле, электрофорез, фиксацию, окраску и высушивание успевают проводить за один день.
Для гель-электрофореза в присутствии ДСН имеется большой набор буферных систем. Лучшее разрешение дают концентрированные буферные системы, у которых верхний (электродный) буфер содержит ионы, обладающие большой подвижностью и движущиеся через гель в виде передней зоны, или фронта. К моменту вхождения в разделяющий гель белки сжимаются этим движущимся фронтом в узкую полосу, а войдя в него, задер-живаются за счет того, что гель обладает свойствами «сита». Описанная ниже система представляет собой модификацию концентрирующей буферной системы, предложенной Лэмли . См. также разд. 26.5.1.
Разделяющий, или разгоняющий, гель содержит 11,5% акриламида, 0,2% бисакриламида и 0,1% ДСН в 0,375 М трис-буфере, доведенном НС1 до pH 8.8. Полимеризация инициируется удалением воздуха из раствора и добавлением тетраметилэтилендиамина (до 0,8%) и персульфата аммония (до 0,015%). Пока не произойдет полимеризация, разделяющий гель держат под слоем воды. Воду выливают и наслаивают концентрирующий гель, или гель для нанесения, содержащий 4,5% акриламида, 0,12% бисакриламида и 0,1 % ДСН в 0,125 М трис-буфере, доведенном НС1 до pH 6,8. Этот гель по- лимеризуется добавлением тетраметилэтилендиамина (до 0,125%) и персульфата аммония (до 0,05%). Перед полимеризацией, чтобы сформировать лунки для проб, в концентрирующий гель вставляют тефлоновую (фторопластовую) гребенку. После полимеризации образовавшиеся лунки промывают несколько раз электродным буфером, содержащим небольшое количество бромфено- лового синего. При этом удаляется непрореагировавший персульфат, а границы лунок слегка окрашиваются, так что их можно видеть при нанесении проб. Верхний электродный буфер содержит 0,182 М глицин, 0,0255 М трис (конечное значение pH 8,3) и 0,1% ДСН. Нижний электродный буфер содержит те же компоненты, за исключением ДСН.
Пробы растворяют в буфере для концентрирующего геля, к которому добавлены 12,5 % глицерина, 1,25% ДСН и 1,25% 2-меркаптоэтанола. До электрофореза их прогревают в течение 5 мин в кипящей водяной бане для того, чтобы прошла полная диссоциация и денатурация всех белков. В качестве красящей метки к пробам можно добавить бромфеноловый синий или феноловый красный. Окончательно приготовленные пробы должны содержать 1-5 мг/мл белка, причем в маленькие лунки (3X0,75 мм) достаточно вносить 5-25 мкг белка. Так как проводимость геля меняется по мере прохождения через него концентрирующего буфера, следует поддерживать постоянными напряжение или мощность, а не ток.
Пока исследуемая смесь не вошла в разделяющий гель, устанавливается начальное напряжение, равное 50 В; затем напряжение повышают до 145 В на весь остаток пути. Для наилучшего разрешения температура геля должна быть 25 °С.
Самый распространенный недостаток электрофореза в полиакриламиде состоит в искривлении полос вследствие неправильно проведенной полимеризации. Чтобы этого не было, гелевые растворы нужно тщательно дегазировать перед заливкой, а верхнюю кромку разделяющего геля после полимеризации несколько раз промы-вать, чтобы удалить все остатки незаполимеризовавше- гося геля. Реактивы для электрофореза бывают разными по чистоте, и для того, чтобы время полимеризации было всегда постоянным, необходимо увеличивать или уменьшать количество персульфата аммойия. Для разделяющего геля оптимальное время полимеризации составляет ~30 мин. При большей длительности гель становится мягким или не полностью полимеризуется, а при меньшей - полимеризация может пройти неравномерно, что приведет к появлению волнистых белковых полос. Персульфат аммония очень гигроскопичен и не отличается стабильностью. Рекомендуется готовить исходный концентрированный раствор персульфата аммония (50 мг/мл), который хранят в замороженном состоянии порциями по 1 мл. Такой раствор стабилен в морозильной камере в течение нескольких месяцев.
Полосы могут быть также размазанными из-за присутствующих в пробе липидов и гликолипидов (распространенный случай - присутствие липополисахаридов). Липиды связывают значительную часть ДСН, и фактически их присутствие может привести к истощению ДСН, доступного для связывания с белками, мигрирующими в геле. Эту трудность преодолевают, увеличивая количество ДСН в верхнем электродном буфере до 1 % и выше.
Гели окрашивают по методу Фейербенкса и др. . При слабом покачивании гели вымачивают по 1 ч в каждом из следующих растворов: 1) 525 мл 95%-ного изопропанола, 200 мл ледяной уксусной кислоты, 1,0 г кумасси ярко-синего и 1275 мл воды; 2) 210 мл 95%-ного изопропанола, 200 мл ледяной уксусной кислоты, 0,1 г кумасси ярко-синего и 1590 мл воды; 3) 200 мл ледяной уксусной кислоты, 0,05 г кумасси ярко-синего и 1800 мл воды и 4) 10%-ная уксусная кислота. После полного обесцвечивания геля его вымачивают перед высушиванием в 10%-ной уксусной кислоте, содержащей 1 % глицерина.
